Sono chiamati “forbici del biologo molecolare”, perché permettono di tagliare il DNA a doppio filamento. I tagli avvengono in corrispondenza di siti di restrizione, specifici per ciascun enzima di restrizione. La maggior parte degli enzimi di restrizione sono isolati da batteri e tale derivazione è richiamata nei loro nomi, ad esempio BamHI è chiamato così perché è isolato da Bacillus amyloliquefaciens. I siti di restrizione, solitamente costituiti da 4 o 6 coppie di basi, possono essere tagliati in due modi diversi che generano estremità piatte o estremità adesive se il taglio produce brevi sporgenze a singolo filamento, complementari tra di loro.
Una delle caratteristiche peculiari degli enzimi di restrizione è l’elevatissima specificità con cui riconoscono e tagliano la sequenza corrispondente al sito di restrizione. È sufficiente un solo nucleotide differente per impedire all’enzima di tagliare il DNA. Questa caratteristica viene sfruttata in ambito biomedico per identificare punti di mutazione di singoli nucleotidi (SNP: Single Nucleotide Polymorphism) nel caso in cui la mutazione si verifichi all’interno di un sito di restrizione.